Akár 24 órával is csökkenthető a Szalmonella vizsgálata egy új módszerrel, amely a tömegspektrometria segítségével azonosítja a mikroorganizmusokat. Mi a lényege a MALDI-TOF elnevezésű azonosítási módszernek, és miért lehet rendkívül elterjedt az elkövetkező években? Valóban forradalmasíthatja a mikrobiológiát? Erről szól legfrissebb cikkünk, nem csak mikrobiológusoknak...

Egyre fontosabb a gyorsaság

A gyorsan változó élelmiszeripari technológiák és táplálkozási irányzatok új kihívások elé állítják az élelmiszerlánc-biztonságot felügyelő szakembereket, laboratóriumokat. A mikrobiológiai laboratóriumok egyik legfontosabb feladata ugyanis az élelmiszerláncba bekerülő alapanyagok, termékek - takarmányok, élelmiszerek - vizsgálata, a kórokozó mikroorganizmusok jelenlétének gyors, megbízható kimutatása, azonosítása. A szabványos, tenyésztéses mikrobiológiai módszerekkel a patogén mikroorganizmusok kimutatása akár 5-8 napot is igénybe vehet, ezért a modern mikrobiológiai módszerek súlypontja a gyors, műszeres analitikai vizsgálatok felé tolódik el – mondta el Lovász Csaba, laboratóriumunk munkatársa, aki kutatóként az Élelmiszervizsgálati Közlemények tudományos szaklapban már megjelentetett egy terjedelmes tanulmányt a témában.

Vízmintából származó baktériumtelepek

A molekuláris biológiai kutatások eredményeinek köszönhetően olyan metodikák válnak rutin laboratóriumi módszerekké, amelyek nagyszámú mintáról, rövid idő alatt, megbízható eredményt szolgáltatnak – folytatta a szakember. Az alternatív mikrobiológiai metodikák egyik legújabb képviselője a a tömegspektrometriás módszerek körébe tartozó MALDI-TOF és az ahhoz kapcsolódó szoftverek, amelyek segítségével mikroorganizmusokat azonosíthatunk percek alatt.

Tömegspektrometriával a „körözött bűnözők” ellen

Egy molekulaszerkezet-kutatási módszer - a tömegspektrometria - hatékony eszköz lehet a mikrobiológusok kezében is, segítségével gyorsan, megbízhatóan azonosíthatók a "körözött bűnözők", azaz a patogén mikroorganizmusok.

A MALDI-TOF betűszó egy speciális tömegspektrométert jelent, a MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) egy fotoionizációs ionforrást, míg a TOF (Time of Flight) egy repülési idő tömeganalizátort jelöl. (a 2002-es kémiai Nobel díjat megosztva a MALDI-módszer kidolgozásáért Koichi TANAKA japán kutató kapta!)

Az identifikálás alapja a mikroorganizmusokban található genetikailag kódolt fehérjék, proteinek. Minden mikroorganizmus egy rá jellemző fehérjeprofilt tartalmaz, amelyet egyfajta ujjlenyomatként használhatunk azonosításukra. Ezt a fehérjeprofilt határozzuk meg a MALDI-TOF vizsgálat során, majd ezt hasonlítjuk össze a referenciakönyvtárban található mikroorganizmusok fehérjeprofiljával.

Forradalmasítja a mikrobiológiát?

A molekuláris biológia fejlődésével egyre mélyrehatóbb ismeretekkel rendelkezünk a minket körülvevő biótákról, mikroorganizmusokról, így a humán megbetegedéseket okozó patogén kórokozókról is. A genetikai anyaguk, a DNS-ük feltérképezésétől kezdve a sejtjeiket felépítő molekulák, fehérjéik szerkezetének meghatározásán át, az általuk termelt toxinok szerkezetének felderítéséig igen széleskörű tudásanyag áll birtokunkban ezekről a fontos mikroorganizmusokról, amely segítségünkre lehet az azonosításuk során is.

A MALDI-TOF módszer vizsgálataihoz mindössze ennyi mintára van szükség

A tömegspektroszkópia egy olyan hatékony szerkezetkutatási módszer, amelynek alkalmazása közben a vizsgálandó molekulákat gázfázisba juttatjuk, ionizáljuk és egy nagyfeszültségű elektromos térrel felgyorsítjuk. A felgyorsított ionokat mágneses, elektrosztatikus, vagy rádiófrekvenciás terekkel tömegük és töltésük szerint elválasztjuk, és meghatározzuk az ionok tömegét. A vizsgált molekula mérete, molekulatömege az egyik legfontosabb szerkezeti információ, amelyet a tömegspektrometria szolgáltat.

Ez a módszer vélhetően forradalmasítja a klasszikus mikrobiológiát. Lehet, hogy ez a vélemény meghökkentő, de vizsgáljuk meg, hogy valójában milyen módon alakíthatja át ez a metodika a szabványos mikrobiológiai vizsgálatokat az élelmiszer, a takarmány és a humán klinikai vizsgálatok területén egyaránt!

Példaként nézzük meg az egyik legelterjedtebb patogén mikroorganizmus, a Szalmonella spp. szabványos meghatározási módszerét! – ajánlja Lovász Csaba.

A vizsgálat során meghatározott mennyiségű (általában 25 g) vizsgálati mintát a szabványban előírt tízszeres mennyiségű elődúsítóban inkubáljuk (18± 2 óra), majd ezt követi a két szelektív tápoldatban (RVS, MKTTn) történő dúsítás (inkubálás 24 ± 3  óra). A fenti szelektív dúsítók a kísérő mikroorganizmusok növekedését gátolják. Ezt a lépést követi a szelektív táptalajokra, illetve egy szabadon választható szelektív lemezre történő szélesztés (inkubálás 24 ± 3  óra). Amennyiben pozitívnak értékeljük a mintát, akkor a szelektív lemezekről izolált telepeket biokémiai próbákkal erősítjük meg (kétszer 24 ± 3  óra), és szerológiai azonosító vizsgálatokkal igazoljuk a Szalmonella spp. jelenlétét, illetve annak hiányát. Látható, hogy a klasszikus, tenyésztéses mikrobiológiai módszerekkel a patogén mikroorganizmusok kimutatása munka és időigényes, akár 5-8 napot is igénybe vehet.

Szalmonella feltételezett pozitív tenyészetei szelektív táptalajokon

A Szalmonella spp. jelenlét/hiány kimutatására széles körben elterjedt, validált műszeres mikrobiológiai módszerekkel már 24 órán belül is kaphatunk negatíveredményt. Azonban a feltételezett pozitív, illetve inhibíciós minták esetén mindenképpen hagyományos tenyésztéses és megerősítő vizsgálatok szükségesek, amelyek ugyancsak időigényesek – magyarázza Lovász Csaba, aki Gorka Ágnes kutatótársával november közepén, a Budapesti Corvinus Egyetemen megrendezett Food Science elnevezésű nemzetközi konferenciáján is bemutatta a MALDI-TOF módszerrel kapott legfontosabb eredményeiket.

A kutatók tapasztalatai azt mutatják, hogy a MALDI-TOF azonosítási módszerrel minden pozitív esetben megbízhatóan azonosították, illetve az összes negatív esetben megbízhatóan zárták ki a Szalmonella spp. jelenlétét, illetve hiányát. A vizsgálatok során további információként azonosították a kísérő mikroorganizmusokat, illetve néhány esetben olyan, nem tipikus morfológiával rendelkező Szalmonella spp. telepeket is identifikáltak, amelyek könnyen megtéveszthetik a gyakorlatlan mikrobiológusok szemét.

További nem elhanyagolható szempont, hogy a MALDI-TOF megerősítő módszerrel legalább 24 órával rövidíthető a vizsgálati idő, ami a humán klinikai vizsgálatok, illetve az élelmiszervizsgálatok esetén különösen fontos tényező.

A mikroorganizmusok azonosításának eredménye a szoftveren

MALDI-TOF – a jövő útja?

A MALDI-TOF-módszer tehát egy rendkívül egyszerű és hatékony eszköz arra, hogy a patogén mikroorganizmusokat, többek között a Szalmonella spp.–t sokkal megbízhatóbban és gyorsabban azonosítsuk, hiszen a vizsgálat ideje legalább 24, de akár 48 órával is csökkenthető.

A módszert könnyen be lehet építeni a rutin mikrobiológiai vizsgálatokba, mert:

-          Egyszerű.

-          Olcsó, (minimális fogyóeszköz és vegyszer igény)

-          Gyors, (minimális minta-előkészítés, rövid a vizsgálati idő) és

-          Felhasználóbarát szoftverekkel

-          Megbízható eredményeket szolgáltat.

-          Hatékony, hiszen egy átlagos munkanapon 300-400 telep azonosítását lehet elvégezni rutin szerűen, így egy készülékkel akár több mikrobiológiai laboratórium kiszolgálása is lehetővé válik.

-          Az adatbázis folyamatosan fejleszthető a felhasználó igényeinek megfelelően.

-          Minden vizsgálat során a MALDI-Biotyper szoftver egy időben több ezer mikroorganizmus között keresi a legjobb találatot.

-          Robosztus: az azonosítási módszer nem függ a tenyészethez alkalmazott táptalaj minőségétől, illetve a mikroorganizmusok azonosítása nem igényel speciális táptalajokat.

A MALDI-TOF módszer talán legnagyobb érdeme, hogy az új technológián alapuló vizsgálati módszereket együtt alkalmazva, rövidebb tenyésztési eljárásokkal akár 24 órán belül is lehetséges lesz a patogén mikroorganizmusok (köztük a Szalmonella) széleskörű kimutatása.

Korunk egyik legnagyobb problémája, az antibiotikum rezisztens fajok megjelenése és egyre szélesebb körű elterjedése. A MALDI-TOF metodika egyrészt lehetőséget nyújt ezen halálos mikroorganizmusok, gyors azonosítására, másrészt új vizsgálati módszerek bevezetésével az antibiotikum rezisztencia vizsgálatok akár 1-2 órára is lerövidíthetőek. Továbbá a MALDI-TOF vizsgálat eredményeinek köszönhetően lehetővé válik a páciensre szabott hatékony antibiotikum kúra megtervezése és alkalmazása is.

Biztosan állíthatjuk, hogy az elkövetkező években olyan új mikrobiológiai módszerek, szabványok születnek, amelyek már kihasználják a MALDI-TOF azonosítási módszerben rejlő lehetőségeket, előnyöket, kombinálva a modern molekuláris mikrobiológia eredményeivel.

A képeket Lovász Csaba készítette, és azok az Élelmiszervizsgálati Közleményekben jelentek meg.

A mikrobiológiai vizsgálatokról  itt tájékozódhat